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    ELISA实验操作中常见的问题分析

    点击次数:172   发布时间:2019/7/24 10:01:00

     由于 ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点,现在已经被广泛的使用,上海恒远生物科技有限公司作为一家专业代理elisa试剂盒、生物试剂、血清、抗体、标准品、对照品、培养基、细胞公司。必须对影响ELISA实验结果各种因素要有一定的认知。优质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。如不注意,就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。现在我们就将ELISA实验操作中的注意事项列举出来,请收好哦!

     
        一、标本及采集,贮运因素
        1.严重溶血,以HRP为标记的ELISA测定中,残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性,催化底物显色造成假阳性;混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔內不易洗净;如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应;标本凝疑固不全,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋臼原,在ELSA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;采血试管冼涤不彻底、反复使用易交叉污染;塑料试管能嘬阼抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
     
        2.血清标本宜在新鲜时检测,严重溶血标本禁用。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,标,在冰箱中保存时间过长导致血清lgG聚合,使间接法的试剂本底加深超过一周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后,蛋臼质局部浓缩,分布不均,应充分混勹并避免产生气泡?;熳腔蛴谐恋淼难灞瓯居ο壤胄幕蚬?,澄凊后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多检测,宜少量分装冰存;*使用一次性璵璃试管或真空管釆血管;并使用非抗凝标本,肝素抗凝血浆会增加OD值,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELsA系统中辣根过氧化物酶活性;血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
     
        二、试剂的影响
        ELISA试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因,人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒,因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被,该类试剂盒的流行病学敏感度不够,稳定性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度科学地对待反应结果?;蚬こ炭乖虾铣呻目乖形蘅杀饶獾挠旁叫?,就 HCV-ELISA试剂盒来讲,*代产品为合成肽抗原,主要是HC∨特异性抗原决定簇的肽片段;第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽,只是当时的基因工程抗原不全,仅包括了HCV的核心区片段第三代产品基本上采用了基因工程抗原,而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCⅴ特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了?;蚬こ炭乖牒铣呻目乖那鹑缦?
     
        基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点。
     
        1.分子量大。合成肽采用化学方法制备,由于工艺的局限,合成数量有限,只能达到数百个氨基酸;而利用基因工程制备的抗原,分子量更大。
     
        2.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证,早期以合成肽为包被抗原的试剂盒期只有3-4个月,采用基因工程抗原后效期大大延长了。
     
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